熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測服務(wù)
更新時間:2020-09-02 點(diǎn)擊次數(shù):1212次
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)檢測
實(shí)驗(yàn)原理
實(shí)時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號,對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。
二、實(shí)驗(yàn)操作步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞傳代
- 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞,評估細(xì)胞匯合的程度以及確認(rèn)無細(xì)菌和真菌污染;
- 移去培養(yǎng)皿(瓶)中的培養(yǎng)液;
- 加入相當(dāng)于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細(xì)胞,一般三次即可;
- 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細(xì)胞。搖晃培養(yǎng)皿(瓶)使其胰蛋白酶覆蓋細(xì)胞單層,倒出多余的胰蛋白酶;
- 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱,放置2-10 min;
- 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞以確保所有細(xì)胞都分離且漂浮,輕拍培養(yǎng)皿(瓶)的一側(cè)來釋放殘留的貼壁細(xì)胞;
- 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞以滅活胰蛋白酶,取出100-200μl用于計(jì)數(shù);
- 將所需數(shù)量的細(xì)胞移至一個新標(biāo)記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶)中;選擇適當(dāng)培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞系;
- 按照細(xì)胞系的生長特性重復(fù)該步驟,直到胞狀態(tài)良好、無污染,可以鋪板使用,其余選擇凍存。
2.活細(xì)胞計(jì)數(shù)
- 取一瓶傳代的細(xì)胞,待長成單層以后使用;細(xì)胞懸液的制備方法:用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌后,加入培養(yǎng)液吹打制成待測細(xì)胞懸液。
- 蓋好蓋玻片,取一套血球計(jì)數(shù)槽,制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液:用吸管吸適量細(xì)胞懸液到離心管中,加入等體積臺盼藍(lán)染液,加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),不考慮細(xì)胞的活力,則可不使用臺盼藍(lán)染色。
- 將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板,注意蓋玻片下不要有氣泡,也不要懸液流入旁邊槽中。
- 統(tǒng)計(jì)四個大格的細(xì)胞數(shù),將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察,并移動計(jì)數(shù)板,當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后,數(shù)出四角的大格(每格含有16個中格)中沒有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
- 計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)。按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度:
6)(細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù))/ml = (四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)×2×104
3.細(xì)胞處理
4.RNA提取
1)細(xì)胞中加入1ml Trizol,將細(xì)胞裂解吸到一個1.5ml的EP管中;
2)加入200ul氯1仿,輕輕顛倒數(shù)次混勻,室溫放置5分鐘;
3)12000rpm,4℃15min 4℃;
4)轉(zhuǎn)上層水相(約400ul)于新1.5ml EP管中,加入400ul異丙醇,混勻,室溫靜置10min;;
5)12000rpm 10min 4℃;
6)棄上清,沉淀用預(yù)冷的70%無水乙醇洗3次,空氣干燥5-10分鐘,溶于20ulDEPC水中;
7)分光光度計(jì)測定RNA濃度。
5.RNA cDNA第.一鏈合成
- 將逆轉(zhuǎn)所需要的物品準(zhǔn)備好,RNA濃度計(jì)算好,tube準(zhǔn)備并標(biāo)記上;
- 在冰浴的nuclease-free PCR管中加入試劑
- 輕輕混勻,42度孵育15分鐘。
- 85度加熱5秒失活TransScript RT/RI和gDNA Remover。
- 將上述溶液-20°C保存。
6.熒光定量PCR檢測
- 將cDNA樣品稀釋10倍作為模板上機(jī)檢測。
- 配制反應(yīng)混合液
- PCR循環(huán)條件
- 儀器的操作
完成上述步驟后,把加好樣品的96孔板放在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。