免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
一、實(shí)驗(yàn)原理
以(抗體和抗原)之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究(蛋白質(zhì)相互作用)的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整(細(xì)胞內(nèi)生理性)相互作用的有效方法。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。
CO-IP應(yīng)用與IP區(qū)別
1、測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合
2、確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔
CO-IP與IP只取決于檢測(cè)焦點(diǎn)是初級(jí)靶分子(抗原)還是次級(jí)靶分子(相互作用蛋白)
二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程
1、提取蛋白。
2、在細(xì)胞裂解液中加入抗X的抗體。
3、孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質(zhì)上)。
若細(xì)胞中有與興趣蛋白結(jié)合的目的蛋白,就可以形成復(fù)合物:“Y—X—抗X抗體—Protein A或G"
4、經(jīng)變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳,復(fù)合物又被分開(kāi)。(xy抗原、x抗體)。
5、western blot分析,質(zhì)譜分析。
(Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì),能特異性地與人和哺乳動(dòng)物抗體(主要是IgG)的Fc區(qū)結(jié)合。)
ProteinA/G的作用及原理
“捕獲”抗體,形成復(fù)合物,
抗體-目的蛋白-ProteinA/G beads 非共價(jià)健結(jié)合
ProteinA/G- beads 共價(jià)結(jié)合
三、CO-IP特征
優(yōu)點(diǎn):
1、相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,處于天然狀態(tài)。
2、蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,可以避免人為的影響。
3、可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
局限性:
1、可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
2、兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,有第三者在中間起橋梁作用;
3、必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么,以選擇后檢測(cè)的抗體,若預(yù)測(cè)不正確,實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果
四、實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵
1、實(shí)驗(yàn)需要注意點(diǎn)就是抗體的性質(zhì)。特別是多抗的特異性是問(wèn)題。
2、為防止蛋白的分解、修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑,低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3、考慮抗體/緩沖液的比例??贵w過(guò)少就不能檢出抗原,過(guò)多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原,過(guò)多則抗原被稀釋。
4、確定蛋白間的相互作用是發(fā)生在細(xì)胞中,而不是由于細(xì)胞的溶解才發(fā)生的,這需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的定位來(lái)確定。
五、注意的問(wèn)題:
1、裂解液
(1)、細(xì)胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細(xì)胞內(nèi)存在的所有蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,多采用非離子變性劑(NP40或Triton X-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的,通過(guò)經(jīng)驗(yàn)確定。
(2)、不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細(xì)胞裂解液中要加各種酶抑制劑,如商品化的cocktail
2、免疫沉淀中抗體的選擇
3、抗體
使用對(duì)照抗體:(陰性和陽(yáng)性)
陰性:?jiǎn)慰寺】贵w:同一種屬的IgG
兔多克隆抗體:正常兔IgG
陽(yáng)性:細(xì)胞內(nèi)某種蛋白的抗體(做膜蛋白A,用膜蛋白B)
六、未檢測(cè)到目得蛋白或蛋白很少
可能原因
1、樣品被蛋白酶降解:
添加蛋白酶抑制劑;所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融
2、抗體濃度太低:
調(diào)整抗體濃度,必要時(shí)設(shè)立濃度梯度,摸索較佳濃度
3、抗抗體親合力太低:
選用適合于IP和/或IB的相應(yīng)抗體
4、IP抗體未與珠子結(jié)合:
選用適合于IP的相應(yīng)珠子,正確保存防止變質(zhì)或干燥
5、Tag未暴露在融合蛋白構(gòu)象的表面:
改變tag融合表達(dá)部位
6、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太高:
改用低嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液
七、目得蛋白高背景
可能原因
1、非特異蛋白結(jié)合:
(1)在無(wú)血清培養(yǎng)液中裂解細(xì)胞;
(2)在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預(yù)洗,
(3)免疫沉淀后增加漂洗次數(shù)和嚴(yán)謹(jǐn)度(高鹽或去垢劑)
2、裂解液嚴(yán)謹(jǐn)度太低:
改用高嚴(yán)謹(jǐn)度裂解液。
3、實(shí)驗(yàn)儀器或液體被污染:
使用潔凈的儀器或液體。
4、轉(zhuǎn)移膜上的非特異吸附:
戴手套,用鑷子夾取,不要接觸膜轉(zhuǎn)移面。
15021202164
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