小鼠皮下成瘤實驗準(zhǔn)備程序
A、細(xì)胞房內(nèi)材料準(zhǔn)備、試劑制備及步驟
(1) 材料準(zhǔn)備:
1. 冰盒、2. 37 ℃ 水浴槽、3. C緩沖溶液(10X)、4. 無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM,DMEM-F12等,不可用 PBS )、5. A膠 (2X)、6. 細(xì)胞培養(yǎng)液、7. 23-26G針頭、8. 1 mL針筒、9. 細(xì)胞。
(2) 試劑制備:
1、C緩沖溶液 (0.5 X) 制備 : 使用 37 ℃ 水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液 (例如: 無血清DMEM或DMEM-F12等,不可用 PBS ) 稀釋 C緩沖溶液 (10 X) 至 C緩沖溶液 (0.5 X), 即體積稀釋20倍。使用前放置37度水浴槽。(例如:1 mL C緩沖溶液 (10 X) + 19 ml 無血清DMEM; 若未使用完畢,可先保存于4 ℃ 冰箱, 保存一周)
2、A膠 (1X) 制備 : 將 A膠 (2X) (貨號:B-P-00003-A) 置于37 ℃ 水浴槽回溫10分鐘,確認(rèn)*溶解。再將 37 ℃ 水浴回溫的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液取 0.5 mL, 加至 37 ℃ 已溶解的 0.5 mL A膠 (2X),配置成 1 mL 的 A膠 (1X)。使用前置于37度,可降低黏度。 (單次使用,勿重復(fù)冷凍解凍 A膠 (1X) )
(3)步驟:
1、取細(xì)胞溶液離心后收集細(xì)胞沉淀,與C緩沖溶液 (0.5 X) 均勻混合使細(xì)胞濃度為3*106 cells/mL。
2、A膠 (1X) 與步驟 1 含 C緩沖溶液 (0.5 X) 的細(xì)胞系懸浮液,按照 2:1 比例均勻混合配置,細(xì)胞懸浮液最終濃度為 106 cells/mL。使用前置于37℃,可降低黏度。 (C緩沖溶液用于A膠凝膠反應(yīng),例如0.5ml C 緩沖溶液(0.5 X)含細(xì)胞 加入 1ml A膠 (1X) 混合成1.5ml 的注射液)
3、選用 23-26 G 的針頭 (建議選用 24 G) 及 1 mL 針筒,抽取 步驟2 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液至所需注射體積 (例如:0.2-0.6 mL) 。室溫37℃至20℃操作抽取。 (若抽取時發(fā)生塞針狀態(tài),可先把針頭拔掉,以針筒進行抽取,建議一次抽取配置好所需針筒數(shù)量,避免步驟2 溶液過度凝膠,發(fā)生塞針)
4、將抽取好步驟 3 的針筒,帶入動物房, 若短時間無法施打建議置于冰上。
B、動物房內(nèi)材料準(zhǔn)備及步驟
(1)材料準(zhǔn)備:
1. 含 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液的針筒、2. 皮膚消毒劑 (例如 : 酒精)、
3. 手套、4. 實驗小鼠、5. 麻醉小鼠的試劑
(2)步驟:
1、室溫下可直接注射。若是置于冰盒上的針筒,回到室溫后,待液化再進行注射。 含 A膠與 C緩沖溶液的細(xì)胞混合液的針筒,以皮下注射方式,注射實驗所需的體積至實驗鼠 (建議皮下注射量為 0.2 mL,實際狀況依需求而定)。(針筒放冰上注射阻力會上升, 放室溫會液化注射阻力小。注射時若因凝膠緣故而阻力變大,需緩慢注射避免針頭噴落)
注1 : 注射體積可依不同實驗?zāi)康淖稣{(diào)整,若為皮下血管生成研究注射體積需至少0.5 mL以上。
注2 : 此步驟依實驗需求可執(zhí)行或不執(zhí)行,若需呈現(xiàn)明顯的皮下注射隆起效果,可調(diào)整2.試劑制備將C緩沖溶液 (10 X) 稀釋15倍,變成C緩沖溶液 (0.66 X),再執(zhí)行后續(xù)成膠實驗;提高C濃度,可提高膠體硬度。
2、培養(yǎng)一至三周后觀察量測接種的腫瘤尺寸。
注3 : 若為血管生成研究,應(yīng)注射含VEGF及heparin的A膠,以促進血管生成。約三天后,可摘取含有新血管生成的腫瘤組織。
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