無論是實(shí)驗(yàn)室規(guī)模樣品制備、還是生產(chǎn)規(guī)模工藝過程,去除核酸都可以改善工藝流程,如蛋白純化、病毒載體制備、mNGS中樣品處理等過程。而核酸酶的選擇,就顯得特別重要。Heat Labile-Salt Active Nuclease (熱不穩(wěn)定性耐高鹽核酸酶,HL-SAN) 是一種非特異性內(nèi)切酶,在高鹽濃度下具有較佳活性;且該酶在多種緩沖液中都有活性,很容易通過還原劑處理而失活。這些特性使HL-SAN在需要去除DNA和RNA的應(yīng)用中,更為適合。
核酸污染,特別是宿主基因組DNA污染,在幾乎所有工藝流程及生物制品的生產(chǎn)中,都是需要重點(diǎn)解決的問題。一方面,宿主DNA的存在,影響目標(biāo)產(chǎn)物的純化及下游質(zhì)量分析等。另一方面,宿主DNA殘留能引起機(jī)體嚴(yán)重的免疫反應(yīng),是生物制品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù)之一,F(xiàn)DA及NMPA等對(duì)Host Cell DNA (HCD)有嚴(yán)格的質(zhì)控要求。
宿主基因組DNA中,組蛋白與DNA形成核小體,核小體緊密折疊形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的染色質(zhì)。組蛋白與DNA間存在強(qiáng)烈的離子作用及疏水作用,再加上特殊的結(jié)構(gòu),導(dǎo)致宿主DNA很難被準(zhǔn)確檢測(cè)并清除。已有文獻(xiàn)表明,高鹽濃度下組蛋白與DNA解離相對(duì),這有利于宿主DNA的檢測(cè)及去除。但市售的絕大多數(shù)核酸酶在高鹽濃度下活性很弱,甚至失活。而耐高鹽的HL-SAN成了這類應(yīng)用的理想選擇。
高鹽濃度能夠提高去除效率
HL-SAN是一種新型的、耐高鹽的工程化內(nèi)切酶。該酶在0.5 M NaCl條件下具有較佳活性,是去除宿主DNA污染的理想選擇。
鹽濃度是去除過程的重要參數(shù)之一。高鹽濃度下,宿主DNA與蛋白質(zhì)能夠解離,從而更容易被降解。
推薦應(yīng)用
1. 病原微生物診斷應(yīng)用,如宏基因組測(cè)序(mNGS)樣品去除宿主DNA;
2. 蛋白純化,特別是DNA結(jié)合蛋白;
3. 病毒載體制備,如腺相關(guān)病毒(AAV)、腺病毒(AdV)等;
4. 其他需要去除宿主DNA的應(yīng)用等。
優(yōu)勢(shì)
1. 高鹽條件下,DNA清除效率更高,宿主DNA殘留更少;
2. pI為9.6,容易跟絕大多數(shù)蛋白分離;
3. 還原劑存在時(shí),酶易失活,減少對(duì)后續(xù)流程的影響。
使用指導(dǎo)
1. DNA去除方案
從細(xì)胞抽提物或細(xì)胞裂解液中去除DNA污染,HL-SAN的使用量受到多種因素影響,如細(xì)胞類型、裂解液組成、NaCl濃度、Mg2+濃度、裂解液pH等。參考方案見Figure 1。比如,對(duì)于1ml細(xì)胞裂解樣品,調(diào)整到0.3-0.75 M NaCl濃度,加入1000 U HL-SAN,15℃-37℃溫度條件下孵育30-60min,或者4℃過夜。Mg2+是必須的。
Figure 1. 不同樣品、不同去除要求下,HL-SAN的推薦濃度及反應(yīng)條件。(DNA removal的要求是指通過瓊脂糖凝膠電泳看不到條帶。Decontamination的去除要求是對(duì)23S rDNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)為陰性。)
2. 滅活
滅活是通過添加還原劑(TCEP或DTT)來實(shí)現(xiàn)的,推薦用TCEP(因?yàn)門CEP在磷酸鹽溶液中不穩(wěn)定,特別在中性pH下)。不同工藝流程中,通過改變孵育時(shí)間、溫度和還原劑的濃度等來滅活該酶。一般情況下, 25-37℃反應(yīng)5-10分鐘,可以滅活99%以上的酶。為了避免酶恢復(fù)活性、再次激活,保持低濃度還原劑,如0.1-0.5 mM DTT或TCEP,或延長(zhǎng)滅活反應(yīng)時(shí)間。
3. 去除
HL-SAN的pI是9.6,能夠緊密結(jié)合陽離子交換柱。在pH 9.0條件下用0.2M鹽沖洗,柱子的流出液/廢液中只有不到0.02%酶脫落。需要注意的是,不推薦使用陰離子交換柱去除HL-SAN,因?yàn)镠L-SAN的糖基化修飾會(huì)結(jié)合到柱子上。
Figure 3. HL-SAN緊密結(jié)合在SP-sepharose柱子上(體系是0.2 M鹽濃度,pH 9.0)。
應(yīng)用實(shí)例:
高效去除人體DNA (99.99%)干擾、快速檢測(cè)下呼吸道感染(LRIs)病原
呼吸道感染(RIs)病原的快速檢測(cè)一直是醫(yī)療中亟待解決的問題。RIs樣本類型眾多并且病原含量差別很大,同時(shí)帶有大量的人體細(xì)胞,因此搭建一套快速、高效的樣本處理系統(tǒng)對(duì)于通過高通量測(cè)序進(jìn)行病原檢測(cè)至關(guān)重要。
2019年Nature Biotechnology文章報(bào)道了如下流程。為了盡可能去除宿主DNA、提高檢測(cè)靈敏度,在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的人體宿主細(xì)胞去除、微生物DNA提取和nanopore測(cè)序等三個(gè)步驟都做了對(duì)應(yīng)的優(yōu)化,比如宿主DNA去除時(shí)找到了合適濃度的saponin(2.2%),HL-SAN步驟由兩步減為一步,清洗步驟縮減為2次。從拿到樣本到建庫完成縮短至6hr,且在較終檢測(cè)中達(dá)到了96.6%的敏感性和100%的特異性。
Figure 4. Nanopore宏基因組快檢流程。
酶學(xué)特征
來源:Pichia pastoris
酶比活:≥1.75 x 10^5 Units/mg
酶活定義:在37℃,25mM Tris-HCl,pH8.5 (25℃),5mM MgCl2,500mM NaCl反應(yīng)體系中,一個(gè)單位的HL-SAN在30分鐘內(nèi)消化50 µg/ml的小牛胸腺DNA(Sigma, D-1501),產(chǎn)生OD260nm處1A的吸光值變化。
特異性:非特異性內(nèi)切核酸酶,能夠?qū)捂溂半p鏈的DNA及RNA,消化成5個(gè)堿基為主的寡核苷酸oligos。
酶活條件:(Effective是指活性在較優(yōu)活性10%以上的條件范圍)
References
Nanoporemetagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection.
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Cutting-edge enzymes from Norway 來自挪威酶類
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