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型號： AZ00008 

儲運條件

-20℃

產(chǎn)品組成

產(chǎn)品簡介

基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據(jù)DNA 片段與線性化載體末端的15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景低，是一種簡單、快速的DNA 定向克隆技術(shù)。

Fast One Step Cloning Kit 無縫克隆試劑盒，一次反應可完成單至多個DNA 片段的重組，快僅需5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于95%。Kit 中添加的輔助因子，有效提高克隆陽性率；經(jīng)優(yōu)化的反應體系，能夠一定程度上耐受未純化PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

實驗步驟

1. 實驗流程概要

2. 線性化克隆載體制備

選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向PCR 擴增完成。

① 酶切制備

一些限制性內(nèi)切酶不能有效地消化超螺旋DNA，因此可能會留下不同數(shù)量的未切割載體DNA，降低陽性率。推薦使用LightNingTM 快速內(nèi)切酶進行酶切（單酶切或者雙酶切），使載體線性化wanquan，以降低轉(zhuǎn)化背景（未切割的載體轉(zhuǎn)化獲得的假陽性克?。?/p>

注1：經(jīng)酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，推薦使用雙酶切。

注2：酶切完成后，建議將內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后用于重組反應。

② 反向PCR 擴增制備

為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增。推薦使用預線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

注1：PCR 產(chǎn)物無非特異性條帶時， 推薦使用Template Eliminator（ 貨號：EG21203）消化質(zhì)粒模板即可用于重組反應；反之建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用。

注2：多片段克隆時，建議將PCR 產(chǎn)物純化后使用。

3. 插入片段PCR 引物設(shè)計

PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25 nt（推薦18 nt）序列。假如載體為粘性末端，且3' 端突出，則引物設(shè)計必須包含突出部分；若5' 端突出，則引物設(shè)計可以包含突出部分，也可以不包含。

插入片段正向擴增引物：

5'—上游載體末端同源序列+ 酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列— 3'

插入片段反向擴增引物：

3'—基因特異性反向擴增序列+ 酶切位點（可選）+ 下游載體末端同源序列—5'

注1：盡量選擇無重復序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行克隆，當載體克隆位點上下游25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為40%~60% 時，重組效率高；

注2：本試劑盒所提供的pUC 19 載體（Ampr）連接端序列如下：

4. 插入片段的PCR 擴增

推薦使用高保真PCR Mix 進行擴增，以減少擴增突變的引入。建議使用純化后的PCR 產(chǎn)物進行無縫克隆反應，若PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定為特異性擴增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應超過總反應體積的20%。

5. 重組反應

① 于冰水浴中配置以下反應體系：

a. 適載體用量(ng) = 0.02 × 載體堿基對數(shù)，即0.03 pmol。

b. 插入單片段，適片段用量（ng）= 0.04 × 片段堿基對數(shù)；插入多片段，每片段適用量（ng）= 0.02 × 片段堿基對數(shù)。

注1：若插入單片段的長度大于載體，則應互換載體與插入片段用量；

注2：若插入片段的長度小于200 bp，則插入片段應使用5 倍載體用量；

注3：若按上述公式計算得到的用量超過低/ 高值，則建議直接按低/ 高用量使用；

注4：載體片段過長、插入片段過長或片段數(shù)過多，克隆陽性率均會降低。

重組反應體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。

② 將反應體系置于50℃，反應5~60 min。

注1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較jingzhun的儀器進行反應，反應時間不足或太長克隆效率均會降低；

注2：插入1~2 個片段時，推薦反應時間為5~15 min；插入3~5 個片段時，推薦反應時間為15~30 min；

注3：當載體骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上時，建議延長反應時間到30~60 min；

注4：50℃反應完成后，建議進行瞬時離心，將反應液收集至管底。

③ 將反應液離心管置于冰上冷卻，之后進行轉(zhuǎn)化或者儲存于 -20℃。

注 1： -20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內(nèi)使用。

6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

取5~10 μl 反應液，加入到100 μl 感受態(tài)細胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置30 min。42℃ 熱激45~60 sec，冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng)40~60 min（200 rpm）。將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上，倒置于37℃ 過夜培養(yǎng)。

注1：不同感受態(tài)細胞后的克隆陽性率會有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/μg的感受態(tài)細胞；

注2：菌落數(shù)取決于PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度；

注3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落。

7. 陽性克隆檢測

挑取單菌落至10 μl ddH2O 中混勻，95℃裂解10 min 后，取1 μl裂解液作為模板，進行菌落PCR 鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。

陽性對照的陽性克隆檢測，菌落PCR 引物使用通用引物M13F 與M13R，酶切鑒定用HindIII 與EcoRI。

注1：菌落PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果；

注2：必要時可進一步對陽性結(jié)果進行測序鑒定。

注3：M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC